Prosedur Uji Salmonella
Prosedur Uji Salmonella
Untuk melakukan deteksi cemaran Salmonella pada produk makanan, ada
beberapa metoda yang direkomendasikan untuk digunakan oleh industri
maupun laboratorium analisa lainnya. Salah satunya adalah metoda yang
diterbitkan oleh Badan Standarisasi Internasional, yaitu Standar ISO 6579
: 2002 Microbiology of food and animal feeding stuffs -- Horizontal
method for the detection of Salmonella spp.
Dalam metoda ISO 6579 : 2002 ini terdiri dalam tiga tahapan, tahap
pertama adalah pre-enrichment, tahap kedua adalah selective enrichment,
dan tahap ketiga adalah isolasi pada media agar selektif. Tahap pre
enrichment menggunakan media kultur cair yaitu Buffered Peptone Water
(BPW). Pre-enrichment pada media kultur cair berfungsi untuk
memperbaiki kondisi bakteri yang injured.Tahapan kedua adalah
melakukan selective enrichment pada 2 jenis media kultur cair, yaitu
Rappaport Vassiliadis Salmonella Enrichment Broth (RVS) dan Muller
Kaufman Tetrathionate Novobiocin Broth. Pada tahapan selective
enrichment ini terjadi optimalisasi pertumbuhan Salmonella dan
dihambatnya pertumbuhan bakteri-bakteri penyerta lainnya yang dapat
menggangu pertumbuhan Salmonella, sehingga dapat semakin
meminimalkan hasil false negatif. Tahap ini menggunakan 2 jenis media
selektif yang bertujuan untuk memaksimalkan pertumbuhan dari berbagai
spesies Salmonella yang mungkin terdapat pada sampel. Sebab, terkadang
beberapa jenis spesies Salmonella dapat tumbuh baik pada media kultur
RVS namun tidak dapat tumbuh pada MKTTn, maupun sebaliknya.
Tahapan ketiga adalah melakukan isolasi atau plating pada media agar
selektif yaitu XLD agardan Rambach Agardengan metoda streak/gores
menggunakan jarumose. Pada media XLD agar, Salmonella akan
menggunakan kandungan xylose, laktosa, dan sukrosa menjadi zat asam
yang menyebabkan phenol red berubah menjadi kekuningan atau oranye.
Salmonella juga akan menghasilkan hydrogen sulfit sebagai hasil dari
pemanfaatan thiosulfate dan garam besi (III) yang menyebabkan koloni
Salmonella berwarna hitam.
Pada media Rambach Agar, Salmonella akan tumbuh dan tampak sebagai
koloni berwarna merah. Hal ini disebabkan oleh pemanfaatan propylene
glycol dan reaksinya dengan pH indikator yang menghasilkan warna merah.
Media Rambach Agar mengandung substrat chromogenic untuk mendeteksi
aktifitas pemecahan β-galactosidase oleh Coliform, sehingga dapat
dibedakan antara Salmonella dengan bakteri Coliform lainnya.
Pertumbuhan coliform pada media Rambach Agar akan tampak sebagai
koloni yang berwarna kehijauan atau biru-violet. Sedangkan bakteri dari
kelompok Gram-negatif lainnya akan tampak sebagai koloni yang tak
berwarna, misalnya Proteus dan Shigella
Contoh lain dalam pengujian Salmonella adalah identifikasi Salmonella
pada sampel mayonnaise pada (SNI 01-4473-1998) dengan syarat negative
jika jumlah koloni 25 gr.
Prosedur pengujian deteksi Salmonellasesuai dengan SN-01-2332.2-2006
tentang Tahap-Tahap Uji Salmonella. Tahap uji ini terbagi menjadi
beberapa tahap, yaitu
1) Pra-Pengkayaan
Metode ini diawali dengan pengambilan sampel seberat 25 gr atau 225
ml dengan perbandingan 1 : 9 untuk sampel dan media pengkayaan
(lactose broth). Selanjutnya contoh yang akan diuji dimasukkan ke
dalam wadah plastik yang telah disterilkan dan ditambahkan 225 ml
larutan Lactose Broth (LB). Selanjutkan homogenkan sampel selama 2
menit untuk dianalisa. Secara aseptis, pindahkan larutan contoh dalam
wadah steril yang sesuai. Inkubasi 24 jam ± 2 jam pada suhu 35°C ± 1°C.
Lanjutkan pengujian sesuai dengan prosedur
Silahkan anda amati gambar proses sebelum dan sesudah proses
pengkayaan. Diskusikanlah dengan teman kelompok anda, apa yang
menyebabkan perubahan warna. Reaksi apa yang terjadi pada proses
tersebut.
2) Tahap Pengkayaan
Tahap pengkayaan diawali dengan mengencangkan tutup wadah dan
mengkocok perlahan contoh yang diinkubasi. Untuk produk perikanan
dengan tingkat kontaminasi tinggi, Selanjutnya pindahkan 0,1 ml
larutan contoh ke dalam 10 ml Rappaport-Vassiliadis (RV) medium dan 1
ml larutan contoh ke dalam 10 ml Tetrathionate Broth (TTB); Untuk
jenis produk perikanan lain, pindahkan 1 ml larutan contoh ke dalam
masing-masing 10 ml SCB dan 10 ml TTB
Inkubasi media pengkayaan selektif sebagai berikut:
inkubasi pada RV medium selama 24 jam± 2 jam pada suhu 42°C ± 0,2°C
(Water bath);
Inkubasi pada TTB selama 24 jam ± 2 jampada suhu 43°C ± 0,2°C
(Water bath);
inkubasi pada TTB dan SCB selama 24 jam ± 2 jam pada suhu 35°C ± 1°C
(Inkubator).
3) Tahap Inkubasi
Tahap ini diawali dengan mengocok tabung (dengan vortex) dan dengan
mengggunakan jarum ose (3mm) gores TTB yang diinkubasi ke dalam
media HE, XLD dan BSA. Siapkan BSA sehari sebelum digunakan dan
simpan di tempat gelap pada suhu ruang. Gores ke dalam media yang
sama dari RV Broth atau SCB. Inkubasi cawan BSA, HE dan XLD selama
24 jam pada suhu 35°C ± 1°C. Amati kemungkinan adanya koloni
Salmonella.
4) Pengamatan Morfologi Salmonella
Pengamatan morfologi Salmonella dilakukan dengan mengambil 2 atau
lebih koloni Salmonella dari masing-masing media Agar selektif setelah
24 jam± 2 jam inkubasi. Koloni-koloni Salmonella yang khas (typical)
adalah sebagai berikut:
Pada Hectoen Enteri (HE) Agar. Koloni hijau kebiruan sampai biru
dengan atau tanpa inti hitam. Umumnya kultur
Salmonellamembentuk koloni besar, inti hitam mengkilat atau
hampir seluruh koloni terlihat berwarna hitam.
Pada XLD Agar. Koloni merah jambu (pink) dengan atau tanpa inti
hitam. Umumnya kultur Salmonellamembentuk koloni besar, inti
hitam mengkilat atau hampir seluruh koloni terlihat berwarna
hitam.
Pada Bismuth Sulphite Agar (BSA). Koloni coklat, abu-abu atau
hitam; kadang-kadang metalik. Biasanya media di sekitar koloni
pada awalnya berwarna coklat, kemudian berubah menjadi hitam
(haloeffect) dengan makin lamanya waktu inkubasi.
Metode lain dalam pengujian adalah dengan uji biokimiadan uji
serologi. Dalam pengujian ini dibuat kontrol positif yaitu sampel
yang telah diberi biakan kultur Salmonella sebagai pembanding. Dari
pengkayaan selektif, biakan dari MKTTn dan RVS diinokulasikan
pada media BGA dan XLD untuk tahap inokulasi dan identifikasi.
Pada tahap ini hanya biakan dari BGA yang berasal dari MKTTn yang
menunjukkan pertumbuhan koloni. Sedangkan pada media XLD
tidak ada pertumbuhan koloni. Selanjutnya koloni dari biakan BGA
dilakukan uji identifikasi yaitu uji biokimia dan uji serologi. Uji
biokimia yang dilakukan antar lain sebagai berikut :
a. Uji TSIA (Triple Sugar Iron Agar)
Uji Triple Sugar Iron agar (TSIA) merupakan metode yang
digunakan untuk melihat kemampuan mikroorganisme dalam
memfermentasikan gula. Media yang diguanakan dalam uji TSIA
ini adalah TSIA agar yang mengandung 3 macam gula, yaitu
glukosa 0,1%, laktosa 0,1%, dan sukrosa 0,1%. Selain itu, juga
terdapat indicator fenol merah yang menyebabkan perubahan
warna dari merah orange menjadi kuning dalam suasana asam.
TSIA juga mengandung natrium trisulfat, yaitu suatu substrat
untuk penghasil H2S, ferro sulfat menghasilkan FeS (precipitat),
bewarna hitam untuk membedakan bakteri H2S dengan bakteri
bakteri lainnya.Konsentrasi glukosa adalah 1/10 dari
konsentrasi laktosa atau sukrosa agar fermentasi glukosa saja
yang terlihat
Pada uji TSIA warna media berubah menjadi merah karena
bakteri bersifat basa Perubahan warna media ini menandakan
bahwa bakteri ini tidak memfermentasi laktosa dan sukrosa.
Pada media daerah butt media berubah berwarna kuning ini
menandakan bakteri memfermentasi glukosa. Pembentukan gas
positif ini hasil dari fermentasi H2 dan CO2 dapat dilihat dari
pecahnya dan terangkatnya agar. Pembentukan H2S positif
ditandai dengan adanya endapan berwarna hitam.
b. Uji urease
Uji urease digunakan untuk mengetahui kemampuan mikroba
menghidrolisis urea menjadi amonia. Uji ini menggunakan
urease broth sebagai media diferensial yang dapat membedakan
bakteri penghasil eksoenzim yaitu enzim yang berfungsi untuk
menghidrolisa urea menjadi ammonia. Kandungan urease broth
antara lain larutan buffer, urea, nutrient, serta indicator phenol
red.
Uji urease menunjukkan hasil positif jika terjadi perubahan
warna media dari kuning menjadi merah keunguan karena
amoniak yang dihasilkan menyebabkan lingkungan menjadi
basa. Hasil uji urease negatif jika tidak terjadi perubahan warna
dari kuning menjadi merah keunguan.
c. Uji Dekarboksilasi Lysin
Uji Dekarboksilasi Lysin menggunakan media Xylose-Lysine
Desoxycholate. Agar medium digunakan untuk isolasi
Salmonelladanmemilah organisme lain dengan cara
memfermentasi xylose, dekarboksilasi lysine dan produksi H2S.
Fermentasi xylose sangat lazim bagi kebanyakan organisme
enterik kecuali, Shigella, Providencia,Edwardsiella. Pada media
ini, Salmonellaakan membentuk koloni merah dengan inti hitam,
sedang Pseudomonas dapat tumbuh dengan warna merah dan
Eschericia berwarna kuning. Mikroba lain yang dapat tumbuh
pada media ini antara lain Arizona, Proteus, Aerobacter,
Klebsiella,Citrobacter. Begitu banyak mikroba yang dapat
tumbuh, sehingga media ini kurang dapat memilah
Salmonellapada tahap awal. Sehingga lebih baik digunakan untuk
tahap konfirmasi kontaminan Salmonella.
d. Uji β-galaktosidase
Uji β-galaktosidase digunakan utuk identifikasi beberapa jenis
bakteri seperti Salmonella. Enzim β-galaktosidase merupakan
enzim yang dapat mengubah laktosa menjadi glukosa dan
galaktosa. Beberapa mikroorganisme seperti E. coli, dapat
menggunakan laktosa sebagai sumber karbon. Selain laktosa,
substrat alamiah dari enzim, adalah bahan yang sangat penting,
ONPG (o-nitro-phenyl-β-D-galactopyranoside), dapat digunakan
pula. Β-galaktosidase dapat mengkatalisis ONPG menjadi
galaktosa dan o-nitrofenol. ONPG tidak berwarna tetapi setelah
hidrolisis menjadi o-nitrofenol, akan timbul warna kuning pada
larutan yang alkali. beberapa jenis bakteri yang mampu
melakukan fermentasi terhadap karbohidrat Streptococcus,
Lactobacillus, Zygomonas, Saccharomycetes, Escherichia,
Enterobacter, Salmonella.
e. Uji Indol
Uji Indol bertujuan untuk menentukan kemampuan bakteri
dalam memecah asam amino triptofan. Media ini biasanya
digunakan dalam indentifikasi yang cepat. Hasil uji indol yang
diperoleh negatif karena tidak terbentuk lapisan (cincin)
berwarna merah muda pada permukaan biakan, artinya bakteri
ini tidak membentuk indol dari tryptopan sebagai sumber
karbon, yang dapat diketahui dengan menambahkan larutan
kovacs. Asam amino triptofan merupakan komponen asam
amino yang lazim terdapat pada protein, sehingga asam amino
ini dengan mudah dapat digunakan oleh mikroorganisme akibat
penguraian protein.
f. Uji Voges Proskauer
Uji Voges Proskauer bertujuan untuk mengidentifikasi jenis
bakteri Untuk membedakan bakteri Escherichia coli dengan
Enterobacteraerogenes. Hasilnya uji ini negatif, karena tidak
terbentuk warna merah pada medium setelah ditambahkan a
napthol dan KOH, artinya hasil akhir fermentasi bakteri ini
bukan asetil metil karbinol (asetolin).
Selain uji biokimia, juga terdapat uji serologi untuk
mengidentifikasi adanya Salmonella dalam banhan pangan.
Dalam uji serologi tidak terjadi aglutinasi pada penambahan
antisera polivalen O, H, dan Vi . Jika hasil dari uji biokimia dan uji
serologi contoh atau sampel berbeda dengan hasil kontrol
positif, maka koloni yang tumbuh dari biakan BGA pada contoh
bukanlah Salmonella, sehingga hasil dari pengujian ini dapat
dinyatakan sebagai negatif koloni/25 gr. Hasil ini telah
memenuhi syarat seperti pada SNI 01-4473-1998 yang
mensyaratkan cemaran Salmonellapada mayonnaise adalah
negatif koloni/25 gr.
Salmonellapositif jika pada uji biokimia yang dilakukan hasilnya
sebagai berikut:
TSIA : butt (+), slant (-), gas positif atau negatif dan H2S
positif atau negatif.
Hidrolisis urea : negatif
Dekarbosilasi lysine : positif
Reaksi voges proskauer : negatif
Produksi indol : negatif
Uji serologi: terjadi aglutinasi pada penambahan antisera
polivalen O, H, dan Vi.
g. Uji Biokimia Tambahan
Uji biokimia tambahan dapat dilakukan jika pada biakan masih
diragukan adanya Salmonella atau tidak. Tahapan uji biokimia
tambahan adalah sebagai berikut:
a) Purple Lactose Broth
Pindahkan 1 ose dari TSI Agar miring yang telah diinkubasi
selama 24 jam – 48 jam kedalam phenol red lactose atau
purple Lactose Broth. Inkubasi selama 48 jam ± 2 jam pada
suhu 35°C ± 1°C, tetapi amati setelah 24 jam.
Hasil dinyatakan positif jika terjadi pembentukan asam
(media berubah kuning) dan ditemukan gas pada tabung
durham. Selain itu jika hanya terjadi pembentukan asam saja,
sudah dapat dinyatakan positif. Umumnya
Salmonellamemberikan hasil negatif ditunjukkan dengan
tidak terbentuknya gas pada tabung durham dan warna
merah (phenol red sebagai indikator) atau ungu (bromcresol
purple sebagai indikator) pada seluruh media.
b) Purple Sucrose Broth
Pindahkan 1 ose dari TSI Agar miring yang telah diinkubasi
selama 24 jam – 48 jam kedalam Phenol red sucrose atau
purple sucrose Broth. Inkubasi selama 48 jam ± 2 jam pada
suhu 35°C ± 1°C, tetapi amati setelah 24 jam.
Positif, apabila terjadi pembentukan asam (kuning) dan gas
pada tabung durham. Apabila hanya terjadi pembentukan
asam, maka dapat dinyatakan positif. Umumnya
Salmonellamemberikan hasil negatif, ditunjukkan dengan
tidak terbentuknya gas pada tabung durham dan warna merah (phenol red sebagai indikator) atau ungu (bromcresol
purple sebagai indikator) pada seluruh media.
c. Medium MR-VP
Pindahkan 1 ose dari TSI Agar miring ke dalam media MR-VP Broth dan
inkubasikan selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 35°C ± 1°C.
d. Uji VP
Pindahkan 1 ml MR-VP Broth yang telah diinkubasi selama 48 jam ± 2 jam
pada suhu 35°C ± 1°C ke dalam tabung reaksi steril dan inkubasikan
kembali MR-VP Broth selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 35°C ± 1°C untuk
pengujian Methyl Red. Tambahkan 0,6 ml Alpha Alphanaphtol dan kocok.
Tambahkan 0,2 ml larutan 40% KOH dan kocok kembali. Untuk
mempercepat reaksi tambahkan sedikit Kristal kreatin, dan amati hasilnya
setelah 4 jam. Perubahan warna menjadi merah muda eosin sampai merah
mirah delima (ruby) pada media menunjukkan reaksi positif.Umumnya
Salmonella memberikan reaksi VP negatif.
e. Uji MR
Tambahkan 5 tetes - 6 tetes indikator Methyl Red kedalam media MR - VP
yang telah diinkubasi selama 96 jam. Amati hasilnya dengan segera.
Umumnya Salmonellamemberikan reaksi positif, ditandai dengan
terjadinya difusi warna merah pada media. Terjadinya warna kuning
menunjukkan reaksi negatif.
f. Simmon Citrat Agar
Pindahkan 1 ose dari TSI Agar miring kedalam media Simmon Citrate Agar
miring dengan cara menggores agar miring dan menusuk agar tegak.
Inkubasikan selama 96 jam ± 2 jam pada suhu 35°C ± 1°C.
Hasil dinyatakan positif apabila terjadi pertumbuhan yang biasanya diikuti
dengan perubahan warnadari hijau menjadi biru. Umumnya Salmonella
memberikan hasil citrate positif. Namun jika tidak ada atau sedikit sekali
pertumbuhan dan tidak terjadi perubahan warna, maka hasil dinyatakan
negatif.
Untuk melakukan deteksi cemaran Salmonella pada produk makanan, ada
beberapa metoda yang direkomendasikan untuk digunakan oleh industri
maupun laboratorium analisa lainnya. Salah satunya adalah metoda yang
diterbitkan oleh Badan Standarisasi Internasional, yaitu Standar ISO 6579
: 2002 Microbiology of food and animal feeding stuffs -- Horizontal
method for the detection of Salmonella spp.
Dalam metoda ISO 6579 : 2002 ini terdiri dalam tiga tahapan, tahap
pertama adalah pre-enrichment, tahap kedua adalah selective enrichment,
dan tahap ketiga adalah isolasi pada media agar selektif. Tahap pre
enrichment menggunakan media kultur cair yaitu Buffered Peptone Water
(BPW). Pre-enrichment pada media kultur cair berfungsi untuk
memperbaiki kondisi bakteri yang injured.Tahapan kedua adalah
melakukan selective enrichment pada 2 jenis media kultur cair, yaitu
Rappaport Vassiliadis Salmonella Enrichment Broth (RVS) dan Muller
Kaufman Tetrathionate Novobiocin Broth. Pada tahapan selective
enrichment ini terjadi optimalisasi pertumbuhan Salmonella dan
dihambatnya pertumbuhan bakteri-bakteri penyerta lainnya yang dapat
menggangu pertumbuhan Salmonella, sehingga dapat semakin
meminimalkan hasil false negatif. Tahap ini menggunakan 2 jenis media
selektif yang bertujuan untuk memaksimalkan pertumbuhan dari berbagai
spesies Salmonella yang mungkin terdapat pada sampel. Sebab, terkadang
beberapa jenis spesies Salmonella dapat tumbuh baik pada media kultur
RVS namun tidak dapat tumbuh pada MKTTn, maupun sebaliknya.
Tahapan ketiga adalah melakukan isolasi atau plating pada media agar
selektif yaitu XLD agardan Rambach Agardengan metoda streak/gores
menggunakan jarumose. Pada media XLD agar, Salmonella akan
menggunakan kandungan xylose, laktosa, dan sukrosa menjadi zat asam
yang menyebabkan phenol red berubah menjadi kekuningan atau oranye.
Salmonella juga akan menghasilkan hydrogen sulfit sebagai hasil dari
pemanfaatan thiosulfate dan garam besi (III) yang menyebabkan koloni
Salmonella berwarna hitam.
Pada media Rambach Agar, Salmonella akan tumbuh dan tampak sebagai
koloni berwarna merah. Hal ini disebabkan oleh pemanfaatan propylene
glycol dan reaksinya dengan pH indikator yang menghasilkan warna merah.
Media Rambach Agar mengandung substrat chromogenic untuk mendeteksi
aktifitas pemecahan β-galactosidase oleh Coliform, sehingga dapat
dibedakan antara Salmonella dengan bakteri Coliform lainnya.
Pertumbuhan coliform pada media Rambach Agar akan tampak sebagai
koloni yang berwarna kehijauan atau biru-violet. Sedangkan bakteri dari
kelompok Gram-negatif lainnya akan tampak sebagai koloni yang tak
berwarna, misalnya Proteus dan Shigella
Contoh lain dalam pengujian Salmonella adalah identifikasi Salmonella
pada sampel mayonnaise pada (SNI 01-4473-1998) dengan syarat negative
jika jumlah koloni 25 gr.
Prosedur pengujian deteksi Salmonellasesuai dengan SN-01-2332.2-2006
tentang Tahap-Tahap Uji Salmonella. Tahap uji ini terbagi menjadi
beberapa tahap, yaitu
1) Pra-Pengkayaan
Metode ini diawali dengan pengambilan sampel seberat 25 gr atau 225
ml dengan perbandingan 1 : 9 untuk sampel dan media pengkayaan
(lactose broth). Selanjutnya contoh yang akan diuji dimasukkan ke
dalam wadah plastik yang telah disterilkan dan ditambahkan 225 ml
larutan Lactose Broth (LB). Selanjutkan homogenkan sampel selama 2
menit untuk dianalisa. Secara aseptis, pindahkan larutan contoh dalam
wadah steril yang sesuai. Inkubasi 24 jam ± 2 jam pada suhu 35°C ± 1°C.
Lanjutkan pengujian sesuai dengan prosedur
Silahkan anda amati gambar proses sebelum dan sesudah proses
pengkayaan. Diskusikanlah dengan teman kelompok anda, apa yang
menyebabkan perubahan warna. Reaksi apa yang terjadi pada proses
tersebut.
2) Tahap Pengkayaan
Tahap pengkayaan diawali dengan mengencangkan tutup wadah dan
mengkocok perlahan contoh yang diinkubasi. Untuk produk perikanan
dengan tingkat kontaminasi tinggi, Selanjutnya pindahkan 0,1 ml
larutan contoh ke dalam 10 ml Rappaport-Vassiliadis (RV) medium dan 1
ml larutan contoh ke dalam 10 ml Tetrathionate Broth (TTB); Untuk
jenis produk perikanan lain, pindahkan 1 ml larutan contoh ke dalam
masing-masing 10 ml SCB dan 10 ml TTB
Inkubasi media pengkayaan selektif sebagai berikut:
inkubasi pada RV medium selama 24 jam± 2 jam pada suhu 42°C ± 0,2°C
(Water bath);
Inkubasi pada TTB selama 24 jam ± 2 jampada suhu 43°C ± 0,2°C
(Water bath);
inkubasi pada TTB dan SCB selama 24 jam ± 2 jam pada suhu 35°C ± 1°C
(Inkubator).
3) Tahap Inkubasi
Tahap ini diawali dengan mengocok tabung (dengan vortex) dan dengan
mengggunakan jarum ose (3mm) gores TTB yang diinkubasi ke dalam
media HE, XLD dan BSA. Siapkan BSA sehari sebelum digunakan dan
simpan di tempat gelap pada suhu ruang. Gores ke dalam media yang
sama dari RV Broth atau SCB. Inkubasi cawan BSA, HE dan XLD selama
24 jam pada suhu 35°C ± 1°C. Amati kemungkinan adanya koloni
Salmonella.
4) Pengamatan Morfologi Salmonella
Pengamatan morfologi Salmonella dilakukan dengan mengambil 2 atau
lebih koloni Salmonella dari masing-masing media Agar selektif setelah
24 jam± 2 jam inkubasi. Koloni-koloni Salmonella yang khas (typical)
adalah sebagai berikut:
Pada Hectoen Enteri (HE) Agar. Koloni hijau kebiruan sampai biru
dengan atau tanpa inti hitam. Umumnya kultur
Salmonellamembentuk koloni besar, inti hitam mengkilat atau
hampir seluruh koloni terlihat berwarna hitam.
Pada XLD Agar. Koloni merah jambu (pink) dengan atau tanpa inti
hitam. Umumnya kultur Salmonellamembentuk koloni besar, inti
hitam mengkilat atau hampir seluruh koloni terlihat berwarna
hitam.
Pada Bismuth Sulphite Agar (BSA). Koloni coklat, abu-abu atau
hitam; kadang-kadang metalik. Biasanya media di sekitar koloni
pada awalnya berwarna coklat, kemudian berubah menjadi hitam
(haloeffect) dengan makin lamanya waktu inkubasi.
Metode lain dalam pengujian adalah dengan uji biokimiadan uji
serologi. Dalam pengujian ini dibuat kontrol positif yaitu sampel
yang telah diberi biakan kultur Salmonella sebagai pembanding. Dari
pengkayaan selektif, biakan dari MKTTn dan RVS diinokulasikan
pada media BGA dan XLD untuk tahap inokulasi dan identifikasi.
Pada tahap ini hanya biakan dari BGA yang berasal dari MKTTn yang
menunjukkan pertumbuhan koloni. Sedangkan pada media XLD
tidak ada pertumbuhan koloni. Selanjutnya koloni dari biakan BGA
dilakukan uji identifikasi yaitu uji biokimia dan uji serologi. Uji
biokimia yang dilakukan antar lain sebagai berikut :
a. Uji TSIA (Triple Sugar Iron Agar)
Uji Triple Sugar Iron agar (TSIA) merupakan metode yang
digunakan untuk melihat kemampuan mikroorganisme dalam
memfermentasikan gula. Media yang diguanakan dalam uji TSIA
ini adalah TSIA agar yang mengandung 3 macam gula, yaitu
glukosa 0,1%, laktosa 0,1%, dan sukrosa 0,1%. Selain itu, juga
terdapat indicator fenol merah yang menyebabkan perubahan
warna dari merah orange menjadi kuning dalam suasana asam.
TSIA juga mengandung natrium trisulfat, yaitu suatu substrat
untuk penghasil H2S, ferro sulfat menghasilkan FeS (precipitat),
bewarna hitam untuk membedakan bakteri H2S dengan bakteri
bakteri lainnya.Konsentrasi glukosa adalah 1/10 dari
konsentrasi laktosa atau sukrosa agar fermentasi glukosa saja
yang terlihat
Pada uji TSIA warna media berubah menjadi merah karena
bakteri bersifat basa Perubahan warna media ini menandakan
bahwa bakteri ini tidak memfermentasi laktosa dan sukrosa.
Pada media daerah butt media berubah berwarna kuning ini
menandakan bakteri memfermentasi glukosa. Pembentukan gas
positif ini hasil dari fermentasi H2 dan CO2 dapat dilihat dari
pecahnya dan terangkatnya agar. Pembentukan H2S positif
ditandai dengan adanya endapan berwarna hitam.
b. Uji urease
Uji urease digunakan untuk mengetahui kemampuan mikroba
menghidrolisis urea menjadi amonia. Uji ini menggunakan
urease broth sebagai media diferensial yang dapat membedakan
bakteri penghasil eksoenzim yaitu enzim yang berfungsi untuk
menghidrolisa urea menjadi ammonia. Kandungan urease broth
antara lain larutan buffer, urea, nutrient, serta indicator phenol
red.
Uji urease menunjukkan hasil positif jika terjadi perubahan
warna media dari kuning menjadi merah keunguan karena
amoniak yang dihasilkan menyebabkan lingkungan menjadi
basa. Hasil uji urease negatif jika tidak terjadi perubahan warna
dari kuning menjadi merah keunguan.
c. Uji Dekarboksilasi Lysin
Uji Dekarboksilasi Lysin menggunakan media Xylose-Lysine
Desoxycholate. Agar medium digunakan untuk isolasi
Salmonelladanmemilah organisme lain dengan cara
memfermentasi xylose, dekarboksilasi lysine dan produksi H2S.
Fermentasi xylose sangat lazim bagi kebanyakan organisme
enterik kecuali, Shigella, Providencia,Edwardsiella. Pada media
ini, Salmonellaakan membentuk koloni merah dengan inti hitam,
sedang Pseudomonas dapat tumbuh dengan warna merah dan
Eschericia berwarna kuning. Mikroba lain yang dapat tumbuh
pada media ini antara lain Arizona, Proteus, Aerobacter,
Klebsiella,Citrobacter. Begitu banyak mikroba yang dapat
tumbuh, sehingga media ini kurang dapat memilah
Salmonellapada tahap awal. Sehingga lebih baik digunakan untuk
tahap konfirmasi kontaminan Salmonella.
d. Uji β-galaktosidase
Uji β-galaktosidase digunakan utuk identifikasi beberapa jenis
bakteri seperti Salmonella. Enzim β-galaktosidase merupakan
enzim yang dapat mengubah laktosa menjadi glukosa dan
galaktosa. Beberapa mikroorganisme seperti E. coli, dapat
menggunakan laktosa sebagai sumber karbon. Selain laktosa,
substrat alamiah dari enzim, adalah bahan yang sangat penting,
ONPG (o-nitro-phenyl-β-D-galactopyranoside), dapat digunakan
pula. Β-galaktosidase dapat mengkatalisis ONPG menjadi
galaktosa dan o-nitrofenol. ONPG tidak berwarna tetapi setelah
hidrolisis menjadi o-nitrofenol, akan timbul warna kuning pada
larutan yang alkali. beberapa jenis bakteri yang mampu
melakukan fermentasi terhadap karbohidrat Streptococcus,
Lactobacillus, Zygomonas, Saccharomycetes, Escherichia,
Enterobacter, Salmonella.
e. Uji Indol
Uji Indol bertujuan untuk menentukan kemampuan bakteri
dalam memecah asam amino triptofan. Media ini biasanya
digunakan dalam indentifikasi yang cepat. Hasil uji indol yang
diperoleh negatif karena tidak terbentuk lapisan (cincin)
berwarna merah muda pada permukaan biakan, artinya bakteri
ini tidak membentuk indol dari tryptopan sebagai sumber
karbon, yang dapat diketahui dengan menambahkan larutan
kovacs. Asam amino triptofan merupakan komponen asam
amino yang lazim terdapat pada protein, sehingga asam amino
ini dengan mudah dapat digunakan oleh mikroorganisme akibat
penguraian protein.
f. Uji Voges Proskauer
Uji Voges Proskauer bertujuan untuk mengidentifikasi jenis
bakteri Untuk membedakan bakteri Escherichia coli dengan
Enterobacteraerogenes. Hasilnya uji ini negatif, karena tidak
terbentuk warna merah pada medium setelah ditambahkan a
napthol dan KOH, artinya hasil akhir fermentasi bakteri ini
bukan asetil metil karbinol (asetolin).
Selain uji biokimia, juga terdapat uji serologi untuk
mengidentifikasi adanya Salmonella dalam banhan pangan.
Dalam uji serologi tidak terjadi aglutinasi pada penambahan
antisera polivalen O, H, dan Vi . Jika hasil dari uji biokimia dan uji
serologi contoh atau sampel berbeda dengan hasil kontrol
positif, maka koloni yang tumbuh dari biakan BGA pada contoh
bukanlah Salmonella, sehingga hasil dari pengujian ini dapat
dinyatakan sebagai negatif koloni/25 gr. Hasil ini telah
memenuhi syarat seperti pada SNI 01-4473-1998 yang
mensyaratkan cemaran Salmonellapada mayonnaise adalah
negatif koloni/25 gr.
Salmonellapositif jika pada uji biokimia yang dilakukan hasilnya
sebagai berikut:
TSIA : butt (+), slant (-), gas positif atau negatif dan H2S
positif atau negatif.
Hidrolisis urea : negatif
Dekarbosilasi lysine : positif
Reaksi voges proskauer : negatif
Produksi indol : negatif
Uji serologi: terjadi aglutinasi pada penambahan antisera
polivalen O, H, dan Vi.
g. Uji Biokimia Tambahan
Uji biokimia tambahan dapat dilakukan jika pada biakan masih
diragukan adanya Salmonella atau tidak. Tahapan uji biokimia
tambahan adalah sebagai berikut:
a) Purple Lactose Broth
Pindahkan 1 ose dari TSI Agar miring yang telah diinkubasi
selama 24 jam – 48 jam kedalam phenol red lactose atau
purple Lactose Broth. Inkubasi selama 48 jam ± 2 jam pada
suhu 35°C ± 1°C, tetapi amati setelah 24 jam.
Hasil dinyatakan positif jika terjadi pembentukan asam
(media berubah kuning) dan ditemukan gas pada tabung
durham. Selain itu jika hanya terjadi pembentukan asam saja,
sudah dapat dinyatakan positif. Umumnya
Salmonellamemberikan hasil negatif ditunjukkan dengan
tidak terbentuknya gas pada tabung durham dan warna
merah (phenol red sebagai indikator) atau ungu (bromcresol
purple sebagai indikator) pada seluruh media.
b) Purple Sucrose Broth
Pindahkan 1 ose dari TSI Agar miring yang telah diinkubasi
selama 24 jam – 48 jam kedalam Phenol red sucrose atau
purple sucrose Broth. Inkubasi selama 48 jam ± 2 jam pada
suhu 35°C ± 1°C, tetapi amati setelah 24 jam.
Positif, apabila terjadi pembentukan asam (kuning) dan gas
pada tabung durham. Apabila hanya terjadi pembentukan
asam, maka dapat dinyatakan positif. Umumnya
Salmonellamemberikan hasil negatif, ditunjukkan dengan
tidak terbentuknya gas pada tabung durham dan warna merah (phenol red sebagai indikator) atau ungu (bromcresol
purple sebagai indikator) pada seluruh media.
c. Medium MR-VP
Pindahkan 1 ose dari TSI Agar miring ke dalam media MR-VP Broth dan
inkubasikan selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 35°C ± 1°C.
d. Uji VP
Pindahkan 1 ml MR-VP Broth yang telah diinkubasi selama 48 jam ± 2 jam
pada suhu 35°C ± 1°C ke dalam tabung reaksi steril dan inkubasikan
kembali MR-VP Broth selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 35°C ± 1°C untuk
pengujian Methyl Red. Tambahkan 0,6 ml Alpha Alphanaphtol dan kocok.
Tambahkan 0,2 ml larutan 40% KOH dan kocok kembali. Untuk
mempercepat reaksi tambahkan sedikit Kristal kreatin, dan amati hasilnya
setelah 4 jam. Perubahan warna menjadi merah muda eosin sampai merah
mirah delima (ruby) pada media menunjukkan reaksi positif.Umumnya
Salmonella memberikan reaksi VP negatif.
e. Uji MR
Tambahkan 5 tetes - 6 tetes indikator Methyl Red kedalam media MR - VP
yang telah diinkubasi selama 96 jam. Amati hasilnya dengan segera.
Umumnya Salmonellamemberikan reaksi positif, ditandai dengan
terjadinya difusi warna merah pada media. Terjadinya warna kuning
menunjukkan reaksi negatif.
f. Simmon Citrat Agar
Pindahkan 1 ose dari TSI Agar miring kedalam media Simmon Citrate Agar
miring dengan cara menggores agar miring dan menusuk agar tegak.
Inkubasikan selama 96 jam ± 2 jam pada suhu 35°C ± 1°C.
Hasil dinyatakan positif apabila terjadi pertumbuhan yang biasanya diikuti
dengan perubahan warnadari hijau menjadi biru. Umumnya Salmonella
memberikan hasil citrate positif. Namun jika tidak ada atau sedikit sekali
pertumbuhan dan tidak terjadi perubahan warna, maka hasil dinyatakan
negatif.
Kesimpulan nya apa??
BalasHapus